专栏简介
《Bactiseal抗菌引流导管》专栏是英特格拉在神外世界推出的全新学术咨询平台。旨在传递国内外最新的脑脊液引流中感染预防技术，抗感染诊治病例等专业学术信息。
标题
抗生素浸渍的脑脊液分流管预防导管相关细菌感染的保护活性持续时间
引言
葡萄球菌感染是脑积水脑脊液（CSF）分流管植入后的一个重要并发症，本研究确定了脑脊液分流管的抗菌处理对预防葡萄球菌感染的保护作用。本研究还检验了条件膜（如见于脑出血后脑积水分流时使用的分流管管腔表面）的影响。包括抗生素预防用药在内的传统预防措施只会带来暂时或未经证实的益处。因此，作者开发了一种用利福平和克林霉素浸渍脑脊液分流管的方法，此前研究已经证明，这种方法可以在体外实现8天的保护活性的目标持续时间。本研究证明了该方法的保护时间限制以及处理各种葡萄球菌的有效性，特别是在存在血浆蛋白条件膜的情况下。选取临床分离菌株，5株金黄色葡萄球菌和7株凝固酶阴性葡萄球菌，每隔周接种到分流管中，直到抗菌保护失效。结果表明，该方法在4至56天之间可以抵御所有菌株，且条件膜没有减弱保护作用。用这种方法处理的分流管有望显著降低脑脊液分流感染的发生率。
前言尽管手术技术在改进，但脑脊液（CSF）分流感染的发生率仍然高得令人无法接受，尤其是在新生儿期。这些感染多由葡萄球菌引起，其中凝固酶阴性葡萄球菌占主导地位。在大多数情况下，在置管插入或调整分流管手术过程中，细菌会渗入分流管。尽管许多报道中都有类似说法，但没有明确证据表明围手术期常规预防使用抗生素有任何益处。因此，我们研发了一种工艺，经证明可在8天的目标期限内提供针对凝固酶阴性葡萄球菌的抗菌保护。本研究旨在评估该方法对一系列金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌菌株的保护活性持续时间，并确定蛋白质条件膜存在的情况下，处理过的导管是否保持其活性。
方法导管的处理
根据微生物学、毒理学和物理化学基础，先从一小部分抗葡萄球菌药物中选择抗菌药物。选择标准除了考虑抗菌谱外，还有一个主要标准就是通过硅胶分子基质的扩散能力，不符合该标准的候选化合物包括氨基糖苷类抗生素（例如庆大霉素）和糖肽类抗生素（例如万古霉素）。经过进一步单独和组合试验后，选择的药物为盐酸克林霉素和利福平。将两种抗生素溶解在氯仿中，得到每种药剂重量/体积为0.%的溶液。将分流管在8?C下浸入该抗生素溶液中小时，取出经乙醇清洗并风干，然后将分流管包装并在?C下高压灭菌消毒5分钟。
试验菌
选定4株表皮葡萄球菌，株人葡萄球菌，株溶血性链球菌和5株金黄色葡萄球菌(APIStaph;bioMérieux,Basingstoke,England)。所有菌株均为临床分离株，常规检测均对盐酸克林霉素和利福平敏感。菌株储存在零下0?C的冷冻保护剂中，使用前在7%的马血琼脂（OxoidLtd.，Basingstoke,England）上连续传代培养两次，然后将它们接种到脑心浸出液（[BHI]，OxoidLtd.）中，并在37℃下孵育过夜。
体外试验模型
将处理过的导管和未处理过的对照组导管无菌插入模块化多室测试模型中（图）。导管垂直固定，以避免沉淀物而非活跃粘附细菌的干扰。使用BHI以0ml/h的速率（CSF常规产生速率）持续灌注分流管，并在PO/PCO环境下保持37?C和00%湿度。其中医用级硅胶导管(Silastic)捐赠来源为DowCorning,Maidenhead,England。
图.用于测试抗生素浸渍的脑脊液分流管的灌注模型示意图。A：单个测试模块的组成。测试导管在无菌条件下插入受控环境模块中，该模块充满无菌水并在需要时充当二级静态水槽。模块本身被一个初级加热电路包围，该回路将测试模块保持在37?C，灌注液以选定的流速通过测试导管泵入，当灌注液耗尽时，可对储液罐进行无菌更换。定期收集测试导管的流出物进行培养。B：多模块组合部分，最多包含A中所示的6个模块，所有模块均可同时独立运行。
细菌挑战试验方案
根据经验，预防细菌定植的初始目标期限设定为8天。在第天，导管内通过注入ml的08个菌落形成单位（cfu）/mlBHI培养物接受试验，并夹闭导管小时。然后在无菌条件下更换测试导管和灌注储液罐之间的所有接头和连接管，以避免近端管路细菌定植造成的虚假结果。监测储液罐中的灌注液是否受到接种物的逆行污染。连续灌注导管4天，每日进行微生物监测，包括对导管流出物进行细菌培养和显微镜检查。如果没有定植的证据，则继续重复试验，再进行4天的灌注和监测。如结果仍没有明显的细菌定植，则进行第三轮试验，再灌注导管和监测4天，如此形成8天的挑战和灌注期，以及4天的灌注和监测期。然后从模块中无菌技术取出导管，冲洗出其管腔内容物并培养，并固定导管片段进行扫描电子显微镜检查。
保护活性的持续时间
采用5株表皮葡萄球菌和4株金黄色葡萄球菌进行第二系列实验，重复4天的挑战试验，直至发生细菌定植。
条件膜
使用与第二系列相同的菌株进行第三系列实验，但不同的是，在注射细菌之前，在处理过的导管和对照导管上制备条件膜。通过立即将抽取的新鲜人血以:0的比例稀释到温生理盐水中以保存凝血因子，并将ml该溶液注入测试导管，从而产生条件膜。夹闭导管小时后，开始灌注，并使用相同的周挑战方案进行细菌挑战试验，直到发生细菌定植，此时固定样本以准备用于扫描电子显微镜。对挑战失败导管中的分离株进行鉴定，并通过E-test（ABBiodisk，Solna，Sweden）确定克林霉素和利福平的最低抑菌浓度。所有细菌挑战试验一式三份进行。
结果8天细菌挑战试验
8天细菌挑战试验的结果如表所示。所有菌株在第次挑战后48小时内定植于未经处理的导管（图）。流出物中的活菌计数经过4小时后从接种时的08下降到04到05之间，经过48小时后再次上升到08。先前的实验表明，按照本文所述处理但不含抗生素药物的对照组导管的细菌定植率与本研究中使用的完全未处理的对照组导管相同。相同的7株凝固酶阴性葡萄球菌和5株金黄色葡萄球菌，即使在8天的目标时间内进行了3次挑战，仍未能在处理过的导管上定植。
表：无条件膜的对照组和处理导管组（实验组）所进行的系列细菌挑战试验，设定目标保护期为8天*
*有关流程的详细信息，请参阅细菌挑战试验方案。在每次挑战时细菌均同时接种对照组导管。
?对照组分流管在挑战试验后48小时内被细菌定植（+）。在处理过的导管中没有明确的细菌定植（-），也就是说，在培养物中没有细菌生长，包括拆卸导管后，也没有通过扫描电子显微镜发现细菌。
图.电子显微照片显示灌注4天后处理过的附有条件膜的导管段。注意附着在硅胶表面的不规则条件膜，没有发现细菌。原始放大倍数×5,
保护活性的持续时间
保护活性持续时间的实验结果如表所示。所有菌株在48小时内定植于未经处理的对照组导管。第5次细菌挑战是在开始持续灌注56天后实施，经处理的导管平均9天（范围为7-0天）后开始出现细菌定植。活菌计数在接种时为08，4小时后降至0到03之间，后一直保持在0，直到活菌计数测量在03到05之间而宣告挑战失败，而在接下来的第二天活菌计数上升到08个。根导管（表皮葡萄球菌组，第次挑战）因受到芽孢杆菌的污染而被排除出组。
表：无条件膜的对照组和处理导管组（实验组）所进行的系列细菌挑战试验，确立保护期限*
*在下一次挑战试验前，每次注入08cfu/mlBHI的挑战都要进行4天的灌注和监测，并重复该过程，直到导管出现细菌定植。在每次试验时细菌均同时接种对照组导管。+代表在挑战后48小时内出现细菌定植；++代表在挑战后平均9天（范围为7-0天）内出现细菌定植；-代表没有明确细菌定植，即在培养物中完全没有细菌生长。
条件膜的影响
条件膜的影响如表3所示。导管挑战试验所使用的菌株与确定保护活性持续时间的菌株相同。无论是否存在条件膜，所有菌株均在挑战后48小时内定植于对照组导管。附条件膜的处理导管（图3）显示出与无条件膜导管相同的保护活性持续时间（表皮葡萄球菌，范围为8-0天，平均在第5次细菌挑战试验后9天；金黄色葡萄球菌，范围为7-9天，平均在第5次细菌挑战试验后8天）。活菌计数采用与无条件膜试验相同的模式。根导管（表皮葡萄球菌组，第5次细菌挑战试验）由于铜绿假单胞菌的污染被排除出组。
表3：对照组和处理导管组（实验组）所进行的系列细菌挑战试验，确定保护时间期限及条件膜的影响*
*在下一次挑战试验前，每次注入08cfu/mlBHI的挑战都要进行4天的灌注和监测，并重复该过程，直到导管出现细菌定植。在每次试验时细菌均同时接种对照组导管。+代表在挑战后48小时内出现细菌定植；++代表在挑战后平均9天（范围为8-0天）内出现细菌定植；+++代表在挑战后平均8天（范围7-9天）内出现细菌定植；-代表没有明确细菌定植，即在培养物中完全没有细菌生长。
图3左：电子显微照片显示存在于未经处理且无条件膜导管中的表皮葡萄球菌。注意产生的黏液，表现为细胞间的脱水外聚合物链。原始放大倍数×。右：电子显微照片显示存在于未经处理并附有条件膜的导管中的金黄色葡萄球菌，注意不规则条件膜存在于硅胶表面，硅胶表面明显附着有球菌。原始放大倍率×8,。
讨论儿童脑积水最常见的原因是早产后脑室周围出血。分流后感染发生率在这个年龄组中是最高的，被认为是在实施分流前婴儿长时期住院的结果，使得婴儿在院内出现葡萄球菌菌株定植，这些菌株已被证明比年龄大的儿童和成人中发现的定植菌株更具粘附性和抗生素多重耐药性，并且这些婴儿体表的细菌密度也明显更高。
导致分流后感染的微生物在植入或调整分流装置时渗入分流管和脑脊液，尽管一些研究声称各种预防性使用抗菌药物方案是有效的，但最近一项由美国国立卫生研究院工作组进行的荟萃分析表明，没有证据支持这一点。除了新生儿期存在较高风险外，手术器材也并不总是理想化的，将抗生素加入到制造分流管的硅胶体中是一个很有吸引力的选择，因为它旨在防止细菌定植，即使大量细菌抵达分流管。除微生物因素外，抗生素加入过程和抗生素的存在不得导致机械性能、生物相容性或分流功能的恶化。分流管掺入药物颗粒显然不能满足这些要求，但我们所使用的方法是在分子水平掺入药物，且所使用的浓度对生物相容性或分流功能没有显著影响。此外，抗生素分布在整个硅胶基质中，当分流管被灌注时，会形成缓慢的扩散梯度，在初始峰值释放（可能来自表面结合药物）后，出现低水平释放，并在至5个月内缓慢下降，从而产生持久的活性。然而，值得注意的是药物的释放并不一定等同于预防感染；我们的结果表明，经过4到56天这一段时间后，保护活性已经停止。鉴于存在调整分流管或其他侵入性操作（如术后即刻压力测量）的可能性，保护活性持续时间超出几天是必要的。
虽然有许多方法可以测试生物材料的抗微生物定植能力，但我们认为要获得有效的结果，必须考虑三个因素。首先，试验模型的设计必须包括一个用于长期恒定灌注的设备，该设备还能实现完美的汇入（即无限储液罐）条件，在这种条件下，由于适当且恒定的交换速率，灌注液中的药物浓度可忽略不计。本文描述的模型旨在执行此操作。显然，在任何真实或模拟条件下的活性持续时间都部分取决于灌注率，我们在研究中使用的灌注率近似于人类脑脊液平均生成率。
第二，如果抗菌效果降到保护水平以下，则必须有条件检测到初始抑制（而非杀死）细菌后可能产生持续的抗生素后效应，这是由BHI的周挑战后恢复灌注产生的。这种效果在临床实践中可以看到，当通过抗菌治疗明显根治脑脊液分流中的感染时，但有时会在数周后复发。在体内，存活的细菌暴露于通常缺乏营养的脑脊液中；使用高营养的BHI旨在加速任何存活细菌的恢复和再生。在分流术中，如果在56天后因抗菌活性减弱而发生失败，则在接下来的8到0天，细菌会持续再生。先前的实验表明，当使用人工脑脊液而不是BHI时，细菌再生时间延长，尽管抗菌活性及其持续时间不变。
第三，必须考虑导管表面条件膜蛋白沉积可能产生的影响。这可能会影响挑战试验细菌的粘附，但也可能会否定该分流管处理方法的保护作用。据我们所知，用于抵抗细菌粘附到生物材料表面的修饰物尚未在条件膜存在的情况下进行过测试，尽管临床中常用是表面具有条件膜的生物材料，而不是经过修饰的生物材料。虽然未对条件膜进行分析，但如扫描电子显微镜（图）所示，在实验组和对照组中，条件膜蛋白均过量。对照组导管的细菌定植时间或定植率没有差异，该处理方法的保护效果及其持续时间也没有受到影响。这点可能特别重要，因为脑脊液分流感染发生率最高的是新生儿，而且大多数脑积水发生在脑室周围出血后。直到最近都普遍认为，对于因出血导致脑脊液蛋白水平高的儿童进行脑脊液分流是不安全的，但这一点现在已经被证明是错误的。因此，即使在脑脊液蛋白浓度较高的条件下，必须证明经过处理的分流管也是有效的。
之所以选用本文所述模型而不是动物模型对分流管进行体外试验，是因为动物模型并非必要。在大多数情况下，脑脊液分流的细菌定植最初是局限于管腔的，如此最好在受控环境空间（如本研究所处环境）中进行建模。此次研究与我们早期研究的主要不同之处在于使用BHI（一种浓缩灌注培养基），而不是脑脊液或其合成等效物，我们之前曾将BHI用于其他目的。BHI通过加速细菌的恢复和生长来缩短灌注周期。使用合成脑脊液导致对照组导管出现明显细菌定植是在灌注7至0天后（未发表的数据），而使用BHI的时间则为至天。在大多数医疗中心，分流后外部细菌定植很少与手术相关，实际上更多是由于生物材料的存在而增加了术后伤口感染率。虽然该工艺也有可能预防分流后外部感染，但我们尚未着手证明这一点。此外，在原理上与我们相似的导管相关感染体外模型已在体内得到验证。将实验组和对照组导管节段简单地植入动物体内难以兼顾长期灌注的影响，并且会妨碍管腔测试。另外，组织来源的条件膜仅附着在导管节段的外表面，而不能附着到管腔。
我们无从得知这种分流管处理方法或者这些药剂以同种方式在其他地方是否使用过。Hampl等人报道了使用方法基本相同的分流管，但药剂仅使用了利福平。考虑到可能会产生耐药性，本研究没有单独使用利福平，但使用两种药物展示了明显优势，尤其是在利福平与克林霉素联合使用情况下。此外，根据Hampl等人的研究，他们将9%（按重量计）的药物浸入导管，而在我们研究中浸渍的导管使用的是0.5%克林霉素和0.%利福平。理想情况下，活性药物应仅以足够的速率通过扩散梯度释放，以在生物材料和宿主界面的能斯特层（Nernstlayer）中提供保护性抗菌浓度，除此之外，活性药物应稀释至较低的浓度，以避免出现全身或局部毒性问题。我们之前研究表明，药物浓度高出大约0倍会对硅胶的质量产生不利影响，从而影响阀门的功能。脑脊液分流管植入的三个主要并发症是感染、梗阻和过度引流，较高浓度的抗生素有可能将一种并发症演化为另一种并发症。
本文所述的分流管处理方法有望取得成效，因为它可以在严格的体外试验系统中防止细菌定植，并可用于脑脊液蛋白水平升高的高危患者，不会对机械性能和分流功能产生不利影响，且没有证据产生毒性。目前临床试验正在进行中。
本文译者：
齐洪武，中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院神经外科，副主任医师。
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